一、細胞特性

1. 細胞名稱：K7M2-WT細胞（小鼠骨肉瘤成骨細胞）
2. 形態(tài)：成骨細胞樣，貼壁生長
3. 含量：>1x10⁶ 個/瓶
4. 污染：支原體、細菌、酵母和真菌檢測為陰性
5. 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

二、細胞接收后的處理：
1、貼壁細胞

1. 收到T25方瓶細胞后，請檢查是否漏液，如果漏液，請拍照片發(fā)給我們（凍存管細胞收到后直接37℃水浴復(fù)蘇或直接放置于液氮中長期儲存）。
2. 請先在顯微鏡下確認細胞生長狀態(tài)，去掉封口膜并將T25瓶置于37℃培養(yǎng)約2-3h。
3. 棄去T25瓶中的培養(yǎng)基，換用新鮮的*培養(yǎng)基。
4. 如果細胞長滿（90%以上）請及時進行細胞傳代。
5. 接到細胞次日，請檢查細胞是否污染，若發(fā)現(xiàn)污染或疑似污染，請及時與我們?nèi)〉寐?lián)系。

2、懸浮細胞

1. 收到細胞后，請檢查是否漏液，如果漏液，請拍照片發(fā)給我們。
2. 請先在顯微鏡下確認細胞生長狀態(tài)，去掉封口膜并將15ml離心管置于37℃培養(yǎng)約2-3h。
3. 1200rpm離心5min，棄去15ml離心管中的培養(yǎng)基，細胞沉淀用新鮮的*培養(yǎng)基重懸并培養(yǎng)。
4. 如果細胞長滿（90%以上）請及時進行細胞傳代。
5. 接到細胞次日，請檢查細胞是否污染，若發(fā)現(xiàn)污染或疑似污染，請及時與我們?nèi)〉寐?lián)系。

                      
本公司的細胞培養(yǎng)操作規(guī)程，供參考
一、K7M2-WT細胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1. 準(zhǔn)備H-DMEM培養(yǎng)基，90%；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。
2. 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3. 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存。

二、細胞處理：

1）復(fù)蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

   對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化2-3分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3ml此細胞的培養(yǎng)基終止消化。
3. 輕輕吹打后吸出，移入15ml離心管中，在1200RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)液后吹勻。
4. 移入到事先準(zhǔn)備好的含有5ml培養(yǎng)基的T-25培養(yǎng)瓶中或含有14ml培養(yǎng)基的T-75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。貼壁細胞凍存時，先要消化處理并進行細胞計數(shù)。消化方法按照細胞傳代方法的1-3步驟進行，后的重懸液使用血清。懸浮細胞直接計數(shù)后離心，用血清重懸浮，加DMSO至終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中。本公司按每個凍存管細胞數(shù)目大于1X10⁶個細胞凍存。

注意事項：
1. 收到凍存管細胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。
2. 所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內(nèi)操作，并請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。
3. 細胞用途：僅供科研使用。

發(fā)貨方式：
復(fù)蘇后發(fā)貨：我們復(fù)蘇細胞后發(fā)貨，貨期一周左右，免運費。（氣溫較好建議復(fù)蘇后發(fā)貨）
凍存發(fā)貨(干冰運輸）：需額外增加干冰運費，選擇干冰運輸?shù)奈覀儼l(fā)兩管細胞，為了保證客戶接種可靠性多發(fā)一管。（氣溫低于0℃須凍存發(fā)貨）
細胞發(fā)貨采取專業(yè)的運輸包裝，并選擇快捷的運輸方式（順豐速運或其他空運快遞）
本公司細胞引種來源：ATCC、DSMZ、ECACC、武大細胞庫、上海生化細胞所、中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會等。

細胞培養(yǎng)常用試劑使用問答
1.谷氨酰胺使用方法是什么？
答：谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，故4℃下放置1周可分解50%，使用中單獨配制，置-20℃冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液中。
2.碳酸氫鈉在室溫條件存放是否穩(wěn)定？
答：碳酸氫鈉白色粉末，或不透明單斜晶系細微結(jié)晶。比重2.159。無臭、味咸，可溶于水，微溶于乙醇。其水溶液因水解而呈微堿性，受熱易分解，在65℃以上迅速分解，在270℃時*失去二氧化碳，在干燥空氣中無變化，在潮濕空氣中緩慢分解。
3.培養(yǎng)細胞生長減慢的原因有哪些？其解決辦法有哪些？
 答：可能得原因有：更換了不同的培養(yǎng)液或血清；培養(yǎng)液中一些細胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子等耗盡或缺乏或已被破壞；培養(yǎng)物中有少量細菌或真菌污染；試劑保存不當(dāng)；比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細胞生長實驗找出可能的原因。
解決辦法：增加起始培養(yǎng)細胞濃度；讓細胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液；換入新鮮配制培養(yǎng)液；補加谷氨酰胺或生長因子等；用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物，或用抗生素除菌；血清需保存在-5℃到-20℃；培養(yǎng)液需在2－8℃避光保存；含血清*培養(yǎng)液在2-8℃保存，并在2 周內(nèi)用完；分離培養(yǎng)物，檢測支原體。
4.L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？
答：L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)時非常重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，降解率隨保存溫度而變。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。
5.細胞傳代消化時所用胰酶濃度越高越好嗎？
答：不見得！因為胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH、溫度、胰酶濃度及溶液中是否含有Ca++, Mg++離子和血清等因素有關(guān)。通常情況下，pH 8.0 , 溫度 37 oC 其作用能力*。另外，鈣、鎂離子及血清均能大大降低其消化能力。我們每次進行傳代消化前，一定要用D-Hanks液或PBS液反復(fù)沖洗細胞培養(yǎng)瓶，以便于將含血清的培養(yǎng)基沖洗干凈，這樣就能大大提高消化液的消化能力。通常使用的消化液濃度為：
     (1)0.05％胰蛋白酶＋0.02％EDTA；
     (2)0.25% 胰蛋白酶
     多數(shù)細胞傳代消化可使用0.25％胰蛋白酶＋0.02％EDTA這種消化液。
6.二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么？
答：二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前，用EDTA清洗細胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價離子。